Wadliwa biosynteza cholesterolu związana z zespołem Smitha-Lemli-Opitza cd

Efekt hydrolizy alkalicznej i ekstrakcji rozpuszczalnikiem określono, wzbogacając 0,5 ml osocza kontrolnego 1,0 mg 7-dehydrocholesterol 9-12. Nie wykryto żadnych obcych związków, a odzyskiwanie 7-dehydrocholesterolu było zasadniczo zakończone. Identyfikację 7-dehydrocholesterolu i cholesterolu zweryfikowano dopasowując czasy retencji pochodnych eteru trimetylosililowego naturalnych związków ekstrahowanych z tkanek pacjentów z czasami retencji pochodnych autentycznych związków (Aldrich Chemical, Milwaukee). Sterole wstrzykiwano do 25-mililitrowej kolumny kapilarnej (glikol polietylenowy – Carbowax [CP-Wax 57CB]) i 25-mililitrowej kolumny kapilarnej (polisiloksan dimetylu [CP-Sil 5CB]) (Chrompack, Raritan, NJ) zainstalowany w chromatografach gazowych (Model 5890, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) 9-12. Tożsamość steroli została następnie potwierdzona analizą mobilności na cienkich warstwach chromatograficznych argentation13,14 i widmach masowych10-12 (spektrometr masowy Hewlett-Packard Model 5988) naturalnych i autentycznych związków.
Hodowli tkankowej
Fibroblasty od Pacjenta i pięciu kontrolnych hodowano w butelkach o pojemności 75 cm2 zawierających 10 ml minimalnego niezbędnego podłoża Dulbecco uzupełnionego 10 procentową surowicą płodową (GIBCO, Grand Island, NY). Po dojściu kultur do konfluencji (3 x 106 do 4 x 106 komórek po około jednym tygodniu), jedną po pół do jednej trzeciej każdej hodowli ponownie umieszczono w nowych kolbach i ponownie hodowano. Przed badaniem biosyntezę cholesterolu stymulowano przez inkubację komórek przez 48 godzin w pozbawionym lipidów pożywce wzrostowej. Testy przeprowadzono w dwóch powtórzeniach.
Wyniki
Sterole plazmowe, erytrocytowe i soczewkowe
Rycina 2. Rycina 2. Chromatogramy gazowe pochodnych trimetylosililowych eterów steroidowych neutralnych w osoczu u pacjenta i kontroli (pięcioletni chłopiec). Związki oznaczone pikami I i IV pozytywnie zidentyfikowano odpowiednio jako cholesterol i 7-dehydrocholesterol. Piki II i III oznaczają izomeryczne dehydrocholesterole. Chromografię przeprowadzono izotermicznie w temperaturze 225 ° C na 25-mililitrowej kolumnie kapilarnej CP-Sil 57CB o średnicy wewnętrznej 0,32 mm, z helem jako gazem nośnym o natężeniu przepływu ml na minutę.
Tabela 1. Tabela 1. Poziomy sterolowe w osoczu i erytrocytach od pięciu dzieci z zespołem Smitha-Lemli-Opitza i kontrolami. Figura 3. Figura 3. Widma masowe pochodnych trimetylosililowego etery autentycznego 7-dehydrocholesterolu (górny panel) i 7-dehydrocholesterolu z osocza pacjenta (dolny panel). Wzorzec steroli w osoczu u pięciu pacjentów poddanych chromatografii gazowej na kolumnie kapilarnej był bardzo charakterystyczny i bardzo nietypowy (ryc. 2). Stężenia cholesterolu u pacjentów były nieprawidłowo zmniejszone, poniżej 5 percentyla, w porównaniu do stężeń w grupie kontrolnej (Tabela 1) i dwa lub trzy dodatkowe sterole zostały łatwo wykryte (piki II, III i IV, Figura 2). Widma mas pików II i IV sugerowały, że były to C27 di-nienasycone 3.-hydroksy sterole. W sposób jednoznaczny zidentyfikowaliśmy najwięcej tych związków (pik IV) jako prekursor cholesterolu 7-dehydrocholesterol (rysunek 3)
[więcej w: blimsien, sklerotyzacja podchrzęstna, psk1 lublin ]